Report 1 Biochem lab
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School
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Course
QIM 111
Subject
Biology
Date
Jan 11, 2025
Pages
12
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Pontificia Universidad Católica de ChileFacultad de Ciencias BiológicasLaboratorio de Bioquímica I: Biología CelularBIO266D-1Informe N°1Seguridad, Uso de Micropipetas y Espectrofotometría.Integrantes: Benjamín BosselFrancisca CodocedoRicardo MedinaProfesor: Hugo OlguínFecha de entrega: 25/03/2024
Introducción:El práctico realizado se divide en dos secciones, una primera sobre el uso, manejo, precisión y exactitud de las micropipetas y cómo afecta esto a posibles resultados experimentales; y una segunda sección sobre el uso de espectrofotometría UV-visible para determinar la concentración de moléculas absorbentes en disolución. Durante la primera parte del práctico se busca analizar la exactitud y precisión de las mediciones volumétricas realizadas por micropipetas de distinta graduación. La exactitud de una medición se refiere a la cercanía entre el valor real y el valor experimental. Por otro lado, la precisión de un instrumento se refiere a la cercanía entre valores registrados para la misma medición, es decir, que tan afectado se ve el método por errores aleatorios al realizar la medición (Boyer, 2000, pp. 16-25). Para estimar la exactitud de un método o instrumento se puede realizar la comparación entre el valor teórico o real y el valor experimental, de esta forma se obtiene un valor de error, el cual al aumentar indica una menor exactitud; del mismo modo se puede estimar la precisión de un método mediante la realización de múltiples mediciones para cada dato, en el caso de este práctico se realizaron mediciones en triplicado. Luego de esto se estima la precisión mediante la desviación estándar para las mediciones para un mismo dato. Esto tiene el propósito tanto de estimar precisión como de entregar un valor menos sesgado por condiciones particulares de una medición por separado (Boyer, 2000, pp. 16-25). La principal limitación de una micropipeta es la baja cantidad de volumen que puede medir y traspasar, además de necesitar múltiples graduaciones para medir distintas cantidades; a diferencia de pipetas de vidrio o pipetas serológicas, que miden dentro de un rango mucho más amplio y pueden medir volúmenes mayores a los 5 mL o 5000 microlitros. A pesar de esto las micropipetas presentan mayor precisión y exactitud, pudiendo medir y traspasar volúmenes muy bajos, además de poder medir volúmenes específicos con diferencias de hasta 1 microlitro dentro de su rango de graduación. Además de esto, utilizan puntas de polipropileno que evitan la adhesión de líquidos, disminuyendo la pérdida en cada traspaso de sustancias (Boyer, 2000, pp. 16-25). La segunda sección del práctico utiliza la técnica de espectrofotometría UV-visible, que se basa en la capacidad de ciertas moléculas de absorber la luz en un rango determinado. Para espectrofotometría UV-visible, es aproximadamente entre 200 a 800 nm de longitud de onda. La
técnica se basa en la relación lineal entre la absorbancia de la molécula a una longitud de onda determinada y la concentración de esta, relación que está dada por la ley de Lambert-Beer, que muestra una proporcionalidad entre la absorbancia de una molécula y su concentración en disolución, proporcionalidad que se da solamente para valores de absorbancia entre 0 y 1, es decir, para valores de transmitancia entre 0 y 100%. Esta ley se traduce en la formula: A = ɛ l c, donde A corresponde a la absorbancia de la disolución, ɛ a la absortividad molar, o coeficiente de absorción molar, el cual es una constante que define la eficiencia de la absorción de la molécula a una longitud de onda determinada; l corresponde a la distancia que tiene que recorrer el haz de luz dentro de la disolución, generalmente es 1 cm para simplificar cálculos, y c corresponde a la concentración de la molécula absorbente (Boyer, 2000, pp. 16-25). Esta técnica nos permite realizar un análisis cuantitativo de moléculas absorbentes en una disolución, sin embargo, no todas las moléculas absorben en el rango UV-visible. Para que lo hagan deben presentar un cromóforo, el cual es una estructura molecular rica en electrones pi, que permite la absorción de luz, debido a esto la técnica está limitada a moléculas absorbentes en este rango, por lo que no permite cuantificar elementos o átomos por separado, como una espectroscopía de absorción atómica, que solo permite cuantificar y determinar presencia de átomos metálicos, ni permite caracterizar moléculas y su estructura como otros tipos de espectroscopía, como espectrofotometría IR, espectroscopía de resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas, las cuales entregan datos sobre la estructura y grupos funcionales asociados a moléculas orgánicas, pudiendo identificar cromóforos para la cuantificación en espectrofotometría UV-visible, sin embargo no pueden cuantificar la molécula. Finalmente, la técnica funciona mejor cuando se utiliza la longitud de onda de máxima absorción de la molécula, pues en este punto es mayor la eficiencia de absorción de la molécula y por ende su ɛ, lo que al realizar una curva de calibración se traduce en una mejor sensibilidad del método y resultados más precisos (Boyer, 2000, pp. 16-25). Objetivos del práctico:En la primera sección del práctico se busca determinar si las micropipetas se encuentran calibradas determinando los parámetros de precisión y exactitud de estas. Para la segunda sección del práctico se busca obtener la concentración de una muestra problema de eosina Y, para lo cual se busca determinar la longitud de absorbancia máxima de la molécula, y realizar una curva de calibrado en
pos de obtener el coeficiente de absortividad molar del colorante. Finalmente se busca evaluar la exactitud y precisión de los datos obtenidos comparando estos con bibliografía. Materiales y métodos:Manejo de pipeta1. Se determinaron los pesos de los siguientes volúmenes, realizando mediciones por triplicado, y utilizando un tubo Eppendorf como contenedor del agua para masar:a. 5 y 10 μL con una P10b. 50 μL con una P200c. 750 μL con una P10002. Diluciones seriadas de eosina Y.a. Traspasar 500 μL de agua a un tubo Eppendorf.b. Traspasar 500 μL de la solución concentrada (partiendo por una solución stock de concentración 1 mg/100 mL) al mismo tubo y mezclarlas con la pipeta.c. Se repitió el paso a. y b. de forma consecutiva hasta generar 5 disoluciones seriadas de [1-0,5-0,25-0,125-0,0625] mg/100 mL. Espectrofotometría:1. ESPECTRO DE ABSORCIÓN PARA UN COMPUESTO:a) Utilizando la solución stock de eosina (1 mg/100 mL), se determinó el valor de absorbancia a 400 nm, en una cubeta de plástico de 1 cm de grosor y 1 mL de capacidad. (Habiendo calibrado el equipo previamente a 400 nm con un blanco con agua destilada).b) Se cambió la longitud de onda a 420 nm y se volvió a calibrar el equipo (pasos 3 a 6 de Uso delEspectrofotómetro). Se leyó la absorbancia a 420 nm. Para optimizar el procedimiento se usósiempre la misma cubeta para el blanco y otra distinta para la muestra, asegurándose de que la cubeta no haya estado rayada o sucia.c) Se repitió el procedimiento, cambiando de 20 en 20 nm, hasta llegar a los 700 nm paraobtener el espectro de absorción de cada colorante. Se determinó la longitud de onda del máximo de absorción. Para lo cual se realizaron mediciones de 5 en 5 nm hacia un lado y otro desde la longitud de onda de máxima absorbancia determinada en el barrido anterior. Se anotó el nuevo valor de longitud de onda de máxima absorbancia encontrado. Luego, se midió de 1 en 1 nm hacia
ambos lados de su nuevo registro (o del primero que registró). Se graficaron los datos obtenidos dando el espectro de absorción de la molécula y la longitud de onda de máxima absorción. C. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA MUESTRA PROBLEMA:a) Se midió la absorbancia de la muestra problema (disolución más diluida) a la longitud de onda de absorción máxima calculada en el paso anterior.b) Usando el gráfico ‘Absorbancia v/s Concentración’, construido a partir de 5 mediciones de absorbancia de disoluciones: stock - 1/2 - 1/4 - 1/8 - 1/16; se determinó la concentración de lamuestra problema mediante interpolación.Resultados:Cada volumen de agua fue medido con la micropipeta correspondiente a su rango de medición, realizando medidas por triplicado para estimar la precisión de los datos por medio de la desviación estándar de los datos. Se obtienen valores similares a los esperados considerando la densidad del agua como 1 g/mL, menos en los volúmenes medidos con P10 con errores de (-60% y -70%) para los 5 y 10 microlitros, respectivamente. Cada medición se realizó conteniendo el agua dentro de un tubo Eppendorf, del cual también se determinó la masa experimentalmente por triplicado. Tabla 1. “Masa de diferentes volúmenes de agua medidos con micropipetas”Tubo EppendorfMasa de 5 µm de agua en tubo EppendorfMasa de 10 µm de agua en tubo EppendorfMasa de 50 µm de agua en tubo Eppendorf Masa de 750 µm de agua en tubo Eppendorf Masa 1 (g)1,1081,1061,1091,1601,865Masa 2 (g)1,1051,1101,1091,1551,861Masa 3 (g)1,1061,1081,1081,1561,861Xde masa (g)1,1061,1081,1091,1571,862Masa de agua (g)--------0,0020,0030,0510,756
Tabla 2. “Masa de diferentes volúmenes de agua medidos con micropipetas”Error relativoDesviación estándar (g)Tubo Eppendorf------1,258∙10−35 µm de agua en tubo Eppendorf-60 %1,633∙10−310 µm de agua en tubo Eppendorf-70 %5,000∙10−450 µm de agua en tubo Eppendorf2,0 %2,160∙10−3750 µm de agua en tubo Eppendorf0,8 %1,893∙10−3Se realizan 3 barridos de absorbancia a la solución stock de eosina Y, presentando un valor de longitud de onda de máxima absorción de 522 nm. Las mediciones se realizaron en triplicado para disminuir al máximo el efecto de posibles errores aleatorios en alguna medición particular. Se utilizó el mismo blanco para todas las mediciones de agua destilada.Tabla 3. “Absorbancia de Eosina Y 10 mg/L”Absorbancia 1Absorbancia 2Absorbancia 3Longitud de onda (nm)Xde absorbancia0,0280,0270,0274000,0270,0310,0310,0314200,0310,0460,0440,0444400,0450,1110,1100,1114600,1110,3370,3370,3374800,3370,6550,6540,6535000,6540,7810,7810,7815050,7810,9780,9790,9795100,9871,2031,2031,2035151,2031,2401,2401,2415161,2401,2841,2841,2845171,2841,3111,3121,3125181,3121,3471,3451,3465191,3461,3641,361,3615201,3621,3761,3761,3765211,3761,3761,3771,3775221,3771,3671,3661,3665231,3661,3481,3481,3485241,3481,3081,3081,3085251,3081,0291,0291,0295301,029
0,6590,6590,6595350,6590,3850,3870,3845400,3850,0100,0100,0115600,010-0,007-0,007-0,006580-0,007-0,011-0,011-0,011600-0,011-0,008-0,009-0,008620-0,008-0,008-0,008-0,008640-0,008-0,009-0,008-0,008660-0,008-0,008-0,007-0,007680-0,007-0,008-0,007-0,008700-0,008400450500550600650700-0.10.09999999999999990.30.50.70.91.11.31.5Espectro de absorción de Eosina Y 10 mg/L Lonigitud de onda (nm)AbsorbanciaLongitud de onda de máxima absorción: 522 nmFigura 1. Espectro de absorción de la Eosina Y 10 mg/L: Se realiza el espectro de absorción de la Eosina Y de concentración 10 mg/L, midiendo la absorbancia desde 400 nm a 700 nm de esta disolución por triplicado hasta obtener la longitud de onda de máxima absorbancia (1,377) que corresponde a 522 nm.Tabla 4. “Absorbancia de disoluciones de Eosina Y a 522 nm”DisoluciónAbsorbancia 1Absorbancia 2Absorbancia 3Xde absorbanciaConcentración (mg/L)1/11,3771,3771,3771,377101/20,6760,6770,6760,676333335MP0,5990,5990,5990,5994,422
1/40,3370,3350,3350,335666672,51/80,1610,1610,1620,161333331,251/160,0620,0630,0630,062666670,62502468101200.20.40.60.811.21.41.6f(x) = 0.139463970249828 x − 0.017804016672527R² = 0.999910847418631Curva de calibrado de Eosina Y a 522 nm. Concentración (mg/L)AbsorbanciaConcentración de MP:4,422 mg/LFigura 2. Curva de calibrado la Eosina Y: Se realiza una curva de calibrado de la Eosina Y con diluciones de la disolución stock (10 mg/L), de 1/2; 1/4; 1/8; 1/16, midiendo la absorbancia a longitud de onda máxima 522 nm por triplicado en cada disolución. De la regresión lineal se obtiene la concentración de la muestra problema (MP) correspondiente a 4,422 mg/L y el coeficiente de extinción molar correspondiente a la pendiente de la curva (0,1395 L/ mg · cm) en base a la Ley de Lambert-Beer.Cálculo coeficiente de extinción molar: A=εClEntonces: AC ∙l=¿donde ACcorresponde a la pendiente de la regresión lineal, con l = 1 cm.
ε=0,1395Lmg∙cmCálculo concentración de muestra problema: y = 0,1395x - 0,0178x=0,599+0,01780,1395x=4,422mg/LDiscusión:En primer lugar, respecto a los resultados en la primera sección del práctico se realizaron medidas en triplicado de cada masado de agua para determinar la precisión de cada micropipeta: P10 para las primeras dos mediciones, P100 para la tercera y P1000 para la última. De esta forma se comprobó la calibración de las distintas micropipetas trabajando con distintos volúmenes de líquido dentro de su rango de trabajo. Primero, se observa una baja desviación estándar en las mediciones volumétricas de todas las micropipetas y volúmenes de agua, lo cual nos indica que tanto el instrumento de medición de volumen como la balanza analítica utilizada presentan baja susceptibilidad a errores del tipo aleatorio, es decir, errores derivados del uso de los instrumentos y que son intrínsecos del método; la mayor fuente de error aleatorio en estas mediciones es atribuible a la utilización de balanzas analíticas en salas sin control del flujo de aire, por lo que las mediciones de masas muy pequeñas, como las que fueron medidas, se ven sujetas a variaciones por corrientes de aire en la sala. A pesar de mostrar buenos valores de desviación estándar, indicando una alta precisión de ambos métodos, la exactitud de estos al medir volúmenes o masas muy pequeñas es baja, lo que se observa claramente en los valores de error porcentual que presentan los primeros dos volúmenes (60% y 70%) para el volumen de 5 y 10 microlitros, respectivamente, ambos volúmenes medidos con la micropipeta P10. Habiendo determinado que la precisión es alta y que existe una relativa baja susceptibilidad a errores aleatorios en el análisis estadístico, se puede determinar que existe la influencia de errores de tipo sistemático que inducen un error negativo fuerte en las mediciones de la micropipeta. En contraste con esto, los volúmenes mayores de agua medidos con micropipetas P100 y P1000, no presentan un alto error relativo, indicando que el error en las otras mediciones es particular de las mediciones con la P10, y no de la balanza analítica utilizada; evidenciando que la P10
puede presentar una mala calibración, o que debido a lo mínimo de las mediciones se haya incurrido en error personal, o mal pipeteo, en la realización de estas dos mediciones. Con respecto a la segunda parte del práctico, las disoluciones de eosina Y preparadas exhibían un color rojizo en las condiciones de preparación (pH fisiológico cercano a 7, en agua), lo cual debería verse reflejado en su espectro de absorción. Respecto a los resultados, la región de mayor absorción es desde, aproximadamente, los 450 nm a los 550 nm, siendo el máximo los 522 nm. De acuerdo con las longitudes de onda del espectro visible, el color que más absorbe la eosina Y en estas condiciones es la región del azul al amarillo, de modo que se transmite (y refleja) el color violeta, anaranjado y rojo, obteniendo como resultado una disolución de color rojizo (lo cual se condice con la descripción visual de la misma).Por otra parte, en relación a las condiciones de disolución en las que se encuentra la eosina Y, se tiene que se prepara en un pH inicial de aproximadamente 7, de forma que la eosina Y se encuentra totalmente desprotonada, ya sea si se encuentra en forma de ácido, dados sus valores de pKa (2,9 y 4,5), o si se prepara en forma de sal de sodio (Sabnis, 2010, p. 173). La importancia de esto radica en que la molécula tiene una alta densidad de carga negativa (2 cargas) con una alta energía, las cuales, debido al alto grado de conjugación de los electrones en torno a toda estructura de esta (Sabnis, 2010, p. 173), se encuentran estabilizados por resonancia. El efecto de este fenómeno en el que los electrones están en constante movimiento llevaría a que la diferencia de energía entre el estado basal y el excitado de estos sea menor y, por ende, la longitud de onda de máxima absorbancia sea mayor al no requerir tanta energía para llegar al estado excitado (Boyer, 2000, pp. 141-157). Es así que el valor de 522 nm se condice con el modelo predictivo. No obstante, al consultar el valor de longitud de onda de máxima absorbancia en bibliografía, donde se mide en una disolución de etanol, este resulta ser de 517 nm (Sabnis, 2010, p. 173). Esto podría deberse a que las moléculas de agua, a diferencia del etanol, tiene una mayor capacidad para solvatar las cargas de la molécula y estabilizarlas, de modo que puedan mantenerse con el mismo grado de estabilidad que en la disolución de etanol, pero con más energía que en esta, tal que los electrones conjugados requieran menos energía para alcanzar el estado excitado y por ello se desplace la longitud de onda de máxima absorbancia hacia longitudes de onda de menor energía.En cuanto a los resultados de la determinación de la concentración de eosina Y en la muestra problema mediante una curva de calibración de estándar externo, se obtiene un valor de concentración de 4,422 mg/L que debería ser el correspondiente a la absorbancia de 0,599. Esto solo
podría ser cierto en el caso de que se cumpla la relación directa entre absorbancia y concentración detallada en la Ley de Lambert-Beer. Para esto, se analizan tres parámetros que denotarían el grado de exactitud y precisión de las mediciones: el coeficiente de absorción molar (pendiente de la recta); qué tan representativa es la recta de tendencia lineal (R2); y el intercepto de la recta.Respecto al valor del coeficiente de extinción molar, el valor obtenido es 0,1395 L*mg-1*cm-1(en agua), mientras que el obtenido en bibliografía es 0,1619 L*mg-1*cm-1(en etanol y condiciones básicas), habiendo un 14% de diferencia entre ambos valores. Esta diferencia podría deberse principalmente a que los datos tabulados se miden en condiciones estándar (concentración 1 Molar, 25° C, 1 atm.), mientras que en el práctico se realizaron las mediciones en agua a pH fisiológico (aproximadamente 7) y en condiciones no estándar de presión, temperatura y concentraciones. Junto con esto, un factor que habría afectado importantemente el valor de la absortividad molar de la eosina Y es la formación de puentes de hidrógeno con el agua más fuertes que con el etanol, por lo que la absortividad molar podría haber disminuido al interactuar tan fuertemente las moléculas de eosina Y con las moléculas de agua y disminuir su movilidad en la disolución, afectando la capacidad de estas de absorber la luz (Boyer, 2000, pp. 141-157). Por otro lado, de la ecuación de la recta se infiere que la dispersión de los puntos es mínima, dado que el valor de R2(0,9999) indica que dichos puntos se encuentran dentro del rango lineal en el que la dispersión es mínima y la precisión de las mediciones es alta. Pese a esto, es preciso destacar que el valor de absorbancia de la disolución 1/1 es mayor a 1, lo cual teóricamente estaría fuera del rango lineal en el que se trabaja la absorbancia de forma que se cumpla la Ley de Lambert-Beer (y que la transmitancia no tenga un valor menor al 0%). No obstante, como se comprueba anteriormente, la linealidad no solo no se pierde en este rango, sino es incluso muy alta. Muy probablemente esto se deba a que el valor de absorbancia no se aleja demasiado de 1 (1,377), que el espectrofotómetro sea bastante preciso a absorbancias de hasta 2 (Boyer, 2000, pp. 141-157) y que la linealidad se cumpla a este valor de absorbancia para esta sustancia en particular.Finalmente, el valor del intercepto de la ecuación de la recta (-0,0178 mg/L) se correlaciona con una alta precisión, de modo que se espera que a una concentración de 0 mg/L de eosina Y, la absorbancia tienda a 0 (blanco teórico). Esto, tras haber corroborado la linealidad del rango de valores con el valor de R2, se traduce en una gran fiabilidad en la exactitud de los resultados al interpolar, dado que existe una alta probabilidad de que el punto interpolado desde el valor de absorbancia coincida con
el punto al que correspondería la concentración real de eosina Y en la muestra problema al conocer las relaciones experimentales de absorbancia a distintas concentraciones.Conclusiones:En primer lugar, los resultados de la primera sección del práctico sugieren una descalibración de la micropipeta P10 utilizada en el práctico. Además, se determina una buena precisión y exactitud en las mediciones de las micropipetas P100 y P1000. En relación con la segunda parte del práctico se puede concluir que se determinó la longitud de onda de máxima absorción de la eosina Y (522 nm) mediante la medición de su espectro de absorción, la cual se encontraba “desplazada hacia el rojo” respecto del valor encontrado en bibliografía por efectos del disolvente y condiciones de disolución. Además, se realizó una curva de calibración con la que se determinó el coeficiente de extinción molar de dicha molécula (0,1395 L*mg-1*cm-1) y su concentración en una muestra problema (4,422 mg/L) con una alta precisión y exactitud (R2= 0,9999 e intercepto = -0,0178 mg/L), difiriendo el valor del coeficiente de extinción molar posiblemente a causa de las interacciones entre la eosina Y, y el agua. Bibliografía:Boyer, R. (2000) Modern Experimental Biochemistry. 3º Edición CAPITULO 5, pp. 16-25; 141-157Chakraborty, M., & Panda, A. K. (2011). Spectral behaviour of eosin Y in different solvents and aqueous surfactant media. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 81(1), 458–465. https://doi.org/10.1016/j.saa.2011.06.038Sabnis, R. W. (Ram W. (2010). Handbook of biological dyes and stains synthesis and industrial applications. Wiley-Blackwell. p. 173